Life Science Aktien

Am Montag wird also Medigene im Rahmen einer Telefonkonferenz Details der klinischen Phase II Studie mit Endo-Tag-1 präsentieren. Die wichtigsten Daten sollen schon morgens mitgeteilt werden. Sofort kursieren natürlich alle möglichen Gerüchte und der Kurs der Aktie schiesst endlich nach oben. Wir werden sehen, was Medigene zu sagen hat, inwieweit es vor allem über schon Bekanntes hinausgeht.

Interessant sind eben weitere Infos zu den länger behandelten Patienten und zu möglichen Partnerschaften bzw. wie und wie schnell es weitergeht mit Endo-Tag-1 bei BDSK !!

Ich bin ja sehr positiv zu Endo-Tag seit ich damals alle verfügbaren Infos zu Munich Biochem gelesen hatte.

Nachfolgend habe ich noch einmal sehr ausführlich für mich selbst und für jeden, der mehr über das Potential von Endo-Tag wissen will, Infomaterial zu dem Prinzip von Endo-Tag zusammengetragen, soweit mir eben zugänglich. Es stammt aus Doktorarbeiten oder Patentschriften. Die Quellen sind ausführlich angegeben, alles im Internet frei zugänglich !

Für den Erfolg wichtige Eigenschaften von Endo-Tag, kationischen Liposomen sind folglich:

- sie werden tatsächlich selektiv an proliferierende Endothelzellen gebunden

- sie reichern sich damit in Tumorgefässen an

- sie haben eine sehr kurze Plasmahalbwertszeit von ca. 5 min

- sie haben eine Eigenwirkung, indem sie durch die Bindung an die Endothelzellen einen wachstumshemmenden Effekt auf die Tumorgefässe haben

- sie können Arzneimittel wie Zytostatika einkapseln und dadurch selektiv an den Wirkort transportieren (Drug Targeting)

- sie hemmen die durch TNF-alpha Stimulierung verursachte Freisetzung der entzündungsfördernden Zytokine IL-6 und IL-8 in humanen vaskulären Endothelzellen

- dieser Eigeneffekt korreliert mit dem Zeta-Potential der kationischen Liposomen

Durch diese Eigenschaften ist eine breite Anwendung denkbar/möglich und auch schon in Arbeit, neben der Behandlung von Tumoren (z.B. mit Endo-Tag-1, 1= Paclitaxel, das ist der Wirkstoff von Taxol) auch die Behandlung von Entzündungskrankheiten wie RA, Rheumatoider Arthritis ( z.B. mit Endo-MTX, MTX = Methotrexat) und die Anwendung in der Diagnostik, z.B. bei AMD, altersabhängige Makuladegeneration, einer Sehstörung im Alter.

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nachfolgend also die genannten Auszüge:

Übrigens, ich arbeite meist mit kopieren und markieren, weil das einfach auch eine Frage des Aufwandes ist. Ich will schon aus Zeitgründen keine ewig langen Artikel selbst verfassen. Es geht ja nur um die Auffindung und Bewertung der Knackpunkte ! Ausserdem bevorzuge ich gerade im Biotechsektor immer möglichst Originaltexte, jede Interpretation oder Kommentar ist schon so eine Sache bzgl. Fehlinterpretationen und gerade in dem Bereich sind Details oft entscheidend wichtig, das erlebe ich immer wieder !!

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Hypoxie ist Sauerstoffmangel, Adoptose ist sozusagen das Selbstzerstörungsprogramm der Zellen

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Antiangiogenetische Therapie beim humanen Pankreaskarzinom
nach orthotoper Implantation in die Nacktmaus durch einen
Mikrotubuli-Inhibitor
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von
Michael Friedrich
aus
Regensburg
2006

Bei der Chemotherapie ist für das metastasierte Pankreaskarzinom vor allem Gemcitabine (Gemzar®) zu nennen, welches die höchste Erfolgsquote bei dieser Erkrankung aufweist. Das Chemotherapeutikum, das bis Ende der neunziger Jahre zum Einsatz kam, war
5-Fluorouracil (5-FU), jedoch mit unbefriedigenden Ansprechraten. In
zahlreichen klinischen Studien wurden die Vorteile des Pyrimidin-Antimetaboliten
Gemcitabine gegenüber 5-FU verdeutlicht.
Die Folge, eine kombinierte Radiochemotherapie einzuführen um eine erhöhte
Resektabilität zu erreichen, ist ein neuer Therapieansatz. Hierbei wird mit einer
Bestrahlung von 45 bis 50,4 Gy und einer Applikation von 5-Fluorouracil (5-FU)
vor einer geplanten Operation versucht, das Ziel einer kurativen Tumorreduktion
zu erreichen. Trotz Verbesserungen dieser wichtigen Behandlungsformen
liegt die gesamte 5 Jahres-Überlebensrate nach wie vor bei Männern und Frauen
unter 5 % 1. Es ist daher sinnvoll, neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln und
zu erproben, um wirkungsvoller gegen diese Tumorerkrankung vorgehen zu
können.
Neben der zytotoxischen oder zytostatischen Therapie von Neoplasien wurde in
den letzten Jahren eine neue Strategie zur Behandlung insbesondere von
Tumorerkrankungen entwickelt: die Zerstörung des die Neoplasie versorgenden
Gefäßnetzwerkes bzw. die Hemmung der Gefäßneubildung zur Versorgung einer
wachsenden Gewebsneubildung. Bis zu einem Volumen von ca. 1mm3 ist
Tumorwachstum ohne Gefäßneubildung und Gefäßeinsprossung möglich, da
Tumorzellen über Diffusion mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt werden. Ab
einer Größe von 1mm3 ist weiteres Wachstum nur möglich, wenn die
Raumforderung in der Lage ist, ein eigenes Gefäßnetzwerk aufzubauen. Diese
so genannte „Angioneogenese“ unterliegt einem Gleichgewicht von positiven und
negativen Regulatorproteinen. „Anti-angiogenetische“ Faktoren können die
Ausbildung eines neuen Gefäßnetzwerkes stoppen oder hemmen, indem sie das
Überleben, das Wachstum und die Funktion der einzelnen Endothelzelle
beeinflussen. Weltweit wird an antiangiogenetischen Therapieansätzen
geforscht und bis heute konnten enorme Schritte auf diesem Weg erreicht
werden. Dennoch besteht immer noch ein großer Bedarf an experimenteller und
klinischer Forschung, bevor diese neue Art der Tumortherapie sich in der Klinik
bewähren kann.

1.1. Angiogenese: Physiologische und pathologische Bildung neuer
Blutgefäße
Das Blutgefäßsystem wird luminal von einer einschichtigen Zelllage
ausgekleidet, dem Endothel. Diese Endothelzellen sind untereinander so
miteinander verbunden, dass sie die Richtung des Gefäßes bestimmen und den
Blutfuß aufrechterhalten. Physiologische Gefäßneubildung während der
Embryogenese kann über zwei verschiedene Wege erfolgen: Zum einen durch
Vaskulogenese, bei der Endothelzellen aus nicht differenzierten Zellen
entstehen. Aus diesen Hämangioblasten können endotheliale Vorläuferzellen,
Angioblasten entstehen, die sich zu Endothelzellen ausdifferenzieren. Und
zum anderen durch Angiogenese, bei der es zur Neubildung von Gefäßkapillaren
aus bereits existierenden Blutgefäßen kommt.
Im Rahmen der Tumorerkrankung findet eine pathologische Gefäßneubildung
zumeist in Form von Angiogenese statt. Das Ausmaß der Angiogenese korreliert
in der Regel mit Wachstum, lokale Ausbreitung und Metastasierung von
Tumoren.
1.2. Mechanismen der Angiogenese von Tumoren
Maligne entartete Zellen können oft jahrelang ohne jegliche Aktivität in Geweben
vorliegen (tumor domancy) . Frühe Studien des Tumorwachstums konnten
bisher nicht zeigen, wann oder wie der Übergang in ein angiogenetisches
Stadium während der frühen Tumorentwicklung stattfindet. Der Mechanismus
der zur Tumorangiogenese führt ist sehr komplex. Da Tumore oft
unverhältnismäßig rasch wachsen und die Kapazität des ursprünglichen
Gewebegefäßnetzes, aus welchem Nahrungsbestandteile und Sauerstoff
bezogen werden, sehr schnell nicht mehr ausreicht, wird das Tumorgewebe
hypoxisch. Die Reaktion auf diese Hypoxie ist die Produktion einer Vielzahl
von Mediatoren, die das Wachstum und die Ausbildung neuer Blutgefäße fördern. Diese neuen Blutgefäße wachsen in das Tumorgewebe ein und verursachen
optimale Gegebenheiten für ein Tumorwachstum und eine daraus in Folge
resultierende Metastasierung des Tumors.

Dieser starke Stimulus des Gefäßwachstums, die Sauerstoffarmut in Zellen, ist
unter anderem beim Pankreaskarzinom vertreten. Eine hohe Angiogeneserate
ist in diesem Gewebe dann mit einem vermehrten Tumorwachstum, einer
gesteigerten Metastasenzahl und einem damit herabgesetztem Überleben
verbunden.
1.3. Gefäßwachstum – Angiogenetic Switch
Endothelzellen, aktiviert durch einen angiogenen Stimulus, müssen sich zur
Initiation der angiogenen Kaskade von ihren Nachbarzellen lösen, bevor sie in
das umgebende Gewebe eindringen können. Lokal kommt es zur Auflösung der
Basalmembran und der umgebende extrazellulären Matrix. Als nächstes
beginnen die ersten Endothelzellen an dieser Stelle in Richtung des angiogenen
Stimulus zu migrieren. Hinter der Front der wandernden Zellen erfolgt eine
Proliferation von Endothelzellen, die zur Verlängerung des endothelialen
Stranges führt. Die Stimulation der Zellen erfolgt durch eine Reihe von proangiogenen
Faktoren. Die offenen Enden der gebildeten kapillären Sprosse
verbinden sich dann und von diesen so genannten „loops“ entsteht durch
fortlaufende Migration und Proliferation von Endothelzellen ein Netzwerk von
neuen Gefäßen.
Bislang konnten eine Vielzahl von Faktoren festgestellt werden, welche dazu
beitragen, dass es zur Neoangiogenese kommt. Die Aktivierung von
Endothelzellen stellt einen ersten Schritt dar. Generell können zwei Phasen
unterschieden werden, die prävaskuläre und vaskuläre Phase. In der
prävaskulären Phase besitzt der Tumor keine angiogenen Eigenschaften.
Tumorzellen proliferieren Angiogenese-unabghängig und der Tumor wächst bis
zu einer kritischen Größe. Eine weitere Größenzunahme des Tumors ist erst
nach Induktion der Angiogenese möglich. Die Anregung von „schlafenden“
Tumorzellen der prävaskularen Phase in einen Endothelzell-aktivierenden,
proliferierenden Tumor der vaskulären Phase wurde von Folkman als
„Angiogenetic Switch“ bezeichnet. Dieser wird durch eine lokale Imbalance
zwischen positiven und negativen Regulatoren der Angiogenese im Tumor als
Resultat der Bildung pro-angiogener Faktoren wie vascular endothelial growth
factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF) oder tumor necrosis factor-α (TNF-
α) durch die Tumorzellen bzw. einer Herunterregulierung anti-angiogener
Faktoren eingeleitet 22, 24. Die vaskuläre Phase ist charakterisiert durch
exponentielles Wachstum und Gewebeinvasion der Tumorzellen.

Die Hypothese des „Angiogenetic Switch“ postuliert, dass es bei der
Angiogenese sowohl hemmende als auch aktivierende Faktoren gibt.
Angiogenese - Stimulatoren können in drei Gruppen eingeteilt werden. Die
erste Gruppe besteht aus den endothelialen Wachstumsfaktoren und ihren
Rezeptoren (z.B. VEGF und VEGF-Rs), welche spezifisch auf Endothelzellen
wirken. Die zweite Gruppe umfasst direkt wirkende Faktoren zum Umbau und zur
Morphogenese, wie Zytokine 26 und angiogene Enzyme, welche eine Reihe
von Zielzellen neben Endothelzellen aktivieren. Der wichtigste Vertreter ist der
Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2). Die dritte Gruppe besteht aus indirekt
wirkenden Substanzen wie Adhäsions-Rezeptoren und Matrix-Proteine, wie
Integrin oder Cadherin. Auch Enzyme zum Abbau der Matrix, wie MMP und
uPA spielen eine entscheidende Rolle bei der Gefäßneubildung. Zu den
aktivierenden genetischen Faktoren gehören (Proto-) Onkogene wie Src und
Ras, inhibitorische Gene sind zum Beispiel p53 und das von Hippel-Lindau-Gen.
Zu den Angiogenese - Inhibitoren gehören unter anderem Angiostatin oder
Endostatin. Auch Platelet Factor-4 (PF-4) und Interferon-α.
Der Anschluss an das vaskuläre System eröffnet dem Tumor zusätzlich die
Möglichkeit einer hämatogenen Metastasierung.
1.4. Prinzip der antiangiogenetischen Therapie
Die Bedeutung des Gefäßnetzes bei Tumorwachstum und Metastasierung ist
heute weitestgehend identifiziert und die Möglichkeit, diesen Vorgang zu stören,
eröffnet ein wichtiges therapeutisches Potential. Zwei grundsätzliche Strategien,
die Blutversorgung des Tumors zu hemmen, sind zu nennen: zum einen das
Unterbinden der Entwicklung neuer Blutgefäße (Anti-Angiogenese) zum anderen
das Zielen auf bereits bestehende Tumorgefäße (Vascular Targeting). Vertreter
aus der Gruppe der „Vascular targeting agents“ nützen den strukturellen und
physiologischen Unterschied zwischen tumorösen und normalen Blutgefäßen,
um eine gezielte Zerstörung der Tumor-Gefäßstruktur zu verursachen.

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Inhibition der Angiogenese
durch kationische Liposomen:
Ein neuer Zugang zur Unterdrückung des
Tumorwachstums
INGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Doktorgrades beim
Fachbereich Veterinärmedizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Eingereicht von
BORIS BRILL
Gießen 2001

Im Gegensatz zu der physiologischen Angiogenese ist in Tumoren das Gleichgewicht
zwischen angiogenetischen und antiangiogenetischen Faktoren gestört, so daß ein
Übergewicht zu Gunsten angiogenetischer Faktoren zu finden ist. Dies hat sowohl die
Bildung von strukturell, als auch funktionell abnormaler Blutgefäße im Tumor zur
Folge und führt zum Fehlen protektiver Mechanismen der Gefäße, wie beispielsweise
die Abwesenheit von das Endothelrohr stützenden Perizyten. Darüberhinaus bestehen
Tumorgefäße nicht wie Kapillaren im gesunden Gewebe aus einer homogenen
Endothelzellschicht, sondern man findet mosaikartige Einlagerungen von Blastomzellen
in dem Endothel der Tumorgefäße. Der Grad der Tumorzelleinlagerung in das
Gefäßendothel ist signifikannt für den Grad und die Bereitschaft zur Metastasierung von
Tumoren (Carmeliet P. et al. 2000;Weidner N. et al. 1991).
Tumorgefäße sind strukturell und funktionell abnormal. Im Vergleich zu
physiologischen Gefäßen ist die Vaskularisation im Tumor unorganisiert. Es sind
wechselnde Durchmesser, starke und häufige Verzweigungen sowie Shunts zu finden.
Diese Strukturen haben einen ungeordneten und zugleich variablen Blutfluß im Tumor zur Folge. Daraus resultiert eine partielle Minderversorgung des Parenchyms, so daß man dennoch hypoxische Regionen im Blastom findet. Der diskontinuierliche Blutfluß im Tumor bringt so auch für eine zytostatische Therapie Probleme mit sich. Da es in manchen Regionen des Blastoms keine festgelegte Strömungsrichtung des Blutes gibt, ist die Verteilung eines Therapeutikums im Gewebe ungleichmäßig (Griffioen A.W. et al. 2000). Weiterhin findet in den hypoxischen Gewebeabschnitten eine Selektion der
Tumorzellen statt, die ihre Fähigkeit zur Apoptose verloren haben (Hashizume H. et al.
2000). Sollte es möglich sein mittels eines Therapeutikums die Angiogenese zu
inhibieren, indem die Blutgefäße im und um den Tumor geschädigt werden, kann dies
ein weiterer Ansatz der Krebstherapie sein.
I. 4 Kationische Liposomen
Durch Zusammenlagerung von Lipiden und oder Fettsäuren entstehen kugelartige
Makromoleküle, die Liposomen. Diese Liposomen zeigen einen zellwandähnlichen
Aufbau. Mit der Kombination verschiedener Lipide kann man die Oberflächenladung
Einleitung der Liposomen beeinflussen. So ist es möglich neutrale, kationische oder anionische Liposomen herzustellen. Diese Makromoleküle eignen sich nun für den Transport verschiedener Substanzen. Je nach Struktur der einzusetzenden Substanzen bzw. der Präparation der Liposomen ist es möglich die Stoffe in die Hülle der Liposomen zu
integrieren, oder sie mit dem Lipidfilm zu umgeben. In zahlreichen Publikationen
konnte gezeigt werden, daß Liposomen als Carrier für Wirkstoffe,
Fluoreszenzfarbstoffe, DNA-Komplexe, Makromoleküle oder Schwermetalle eingesetzt
werden können (Drummond D.C. et al. 1999; McLean J.W.et al. 1997; Meyer O. et al.
1998; Sengupta S. et al. 2000; Osaka G. et al.1996; Papahadjopoulos D. et al. 1991;
Lee K.D. et al. 1993). Je nach Ladung und Oberflächenbeschaffenheit der Liposomen,
kommt es zu spezifischen Organverteilungen und Plasmahalbwertszeiten. Die
Formulierung der hier verwendeten Liposomen erlaubt es, hydrophobe Substanzen wie
z. B. Zytostatika (Taxol®) zu binden und so meist in geringeren Dosen als die
nichtliposomalen Vergleichspräparate einzusetzen.
Thurston et al. konnte im Tierversuch zeigen, daß kationische Liposomen vor allem an proliferierenden Endothelzellen binden. Im Vergleich zu kationischen Liposomen gibt es keine Bindung von anionischen oder neutral geladenen Liposomen am Gefäßendothel. Die Plasmahalbwertszeit von kationischen Liposomen liegt jedoch mit weniger als fünf Minuten weit unter dem Wert von neutralen Liposomen. Mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Liposomen konnte in der konfokalen Mikroskopie deren spezifische Anreicherung in den Tumorgefäßen dargestellt werden (Thurston G. et al. 1998).
I. 5 Paclitaxel, Taxol®
Taxol® als zugelassenes Zytostatikum beinhaltet als pharmakologisch wirksame
Substanz den Mitosehemmstoff Paclitaxel.
Paclitaxel ist ein Alkaloid, das ursprünglich aus der Rinde der pazifischen Eibe (Taxus
brevifolia) extrahiert wurde. Der Wirkmechanismus der Taxane wie Paclitaxel und
Docetaxel ist die Verhinderung der Desaggregation des Spindelapparates. Die in der G2-
Phase zum Stofftransport gebildeten Spindeln können danach nicht mehr umgebaut
werden, insbesondere entstehen in der Mitosephase keine Kernspindeln. Dies hat zur
Folge, daß die Mikrotubuli des Spindelapparates in der G2- Phase des Zellzyklus
stabilisiert werden. Durch den verhinderten Abbau des Spindelapparates verharrt die Zelle in der Metaphase, bis dies zur Induktion von Apoptose führt (Schmidt M. et al. 2000).

IV Diskussion:
Ziel dieser Arbeit war es die Wirksamkeit auf das Tumorwachstum eines in der
Krebstherapie eingesetzten Zytostatikums im Vergleich zu einer neuen Formulierung des gleichen Wirkstoffes in einem Maus-Tumormodell zu testen. Der Wirkstoff des Zytostatikums Taxol®, Paclitaxel, wurde an kationische Liposomen gebunden. Diese neue Formulierung macht es zudem möglich auf den Lösungsvermittler Cremophor EL® im Taxol® zu verzichten. Dieser Lösungsvermittler löst in der zytostatischen Therapie oftmals Nebenwirkungen aus, die eine Prämedikation der Patienten mit Kortikoiden nötig machen zur Vermeidung eines anaphylaktischen Schocks. Das in
dieser Arbeit eingesetzte Tumormodell basierte auf der Verwendung von stabil mit
dem lac/Z-Gen transfizierten Nierenkarzinomzellen (Renca-Zellen) der BALB/c-
Maus. Der Einsatz dieser Zellinie ermöglichte das Setzen solider Tumore bei
subcutaner Injektion wie auch die Induktion von Lungenmetastasen bei intravenöser
Injektion in die Schwanzvene der Versuchstiere.

IV. 2 Subcutane Tumoren, Injektion von 5×106 Zellen s.c.,
Behandlungsbeginn an Tag eins post Zellinjektion (Versuch I),
Behandlungsbeginn an Tag elf post Zellinjektion (Versuch II)
Die Evaluierung des Tumorwachstums erfolgte in zwei Behandlungsansätzen der
Versuchstiergruppen:
Bei einer geplanten Versuchsdauer von 25 Tagen wurde eine Gruppe ab Tag 1 nach
der Tumorzellinjektion (5×106 Renca-lac/Z-Zellen s.c. in die seitliche Rückenflanke
der Mäuse) für die darauffolgenden zehn Tage mit an kationischen Liposomen
gebundenem Paclitaxel, Liposomen, Taxol® sowie Glukoselösung i.v. behandelt. In
dem verbleibenden Zeitraum wurde die Volumenzunahme der Tumoren gemessen.
Am Ende des Versuches wurden die Tiere getötet und ihnen die Tumoren wie auch
Leber, Nieren und Milz entnommen und für die histologische Untersuchung
vorbereitet.
Da die Tumore erst nach ca. sechs Tagen als stecknadelkopfgroßes Gebilde fühlbar
waren und ab dem neunten Tag sicher meßbar waren, zeichneten sich deutliche
Wachstumsunterschiede der Tumore erst ab Tag neun ab. Diese Differenzen wurden
von dem Tumorwachstum über die gesamte Versuchsdauer beibehalten. Übertragen
auf einen medizinischen Einsatz kann dieser Versuchsansatz auf eine Therapie im
Anschluß an eine operative Entfernung von Tumorgewebe angesehen werden, da bei
nahezu jeder Operation in der Nähe bzw. am Tumor selbst die Gefahr besteht, daß
sich Tumorzellen lösen und sich im umliegendem Gewebe erneut ansiedeln oder in
weiter entferntere Körperteile metastasieren. Zudem wurde eine weitgehende
Vereinheitlichung im Vergleich zu dem Metasasenmodell im Hinblick auf
Behandlungsdauer und Versuchsdauer angestrebt, da gerade in diesem Modell die
postoperative Metastasierung und der Einfluß einer sofortigen Behandlung der
Patienten untersucht werden kann.
Im zweiten Versuchsansatz wurde zehn Tage nach der Tumorzellinjektion zu einem
Zeitpunkt, an dem die Tumoren bereits im Gewebe der Maus etabliert waren (fühlund
meßbar), mit der Behandlung der Versuchstiere wie oben beschrieben begonnen.
Eine Reduktion der Volumenzunahme der Tumore gegenüber der Kontrollgruppe
(Glukose) konnte auch in diesem Versuchsansatz erzielt werden. Nach der
zehntägigen Behandlung mittels intravenöser Injektion der Präparate mußte der
Tierversuch bedingt durch das Auftreten von Ulzerationen an den subcutanen
Tumoren zur Verhinderung von Schmerzen, Schäden und Leiden der sich im Versuch
befindlichen Versuchstiere beendet werden.
In den Versuchen I und II (Behandlungsbeginn an Tag 1 post Zellinjektion, Versuch I;
Behandlungsbeginn an Tag 11 post Zellinjektion, Versuch II) zeigte sich eine
Wachstumsreduktion bei allen eingesetzten Präparaten (Taxol 25 %, kationischen
Liposomen 40 %, an kationische Liposomen gebundenes Paclitaxel 69 %) im
Vergleich zu den mit Glukose behandelten Kontrollgruppen. Wie Thurston G. (1998) zeigte, ist bedingt durch die Größe der kationischen Liposomen (35 – 50 µm) und deren positiver Ladung zu erwarten, daß diese Liposomen das Gefäßsystem nicht verlassen können. Dies wurde auch von Thurston, G. et al. (1998) in seiner Arbeit gezeigt. Aus diesem Grund ist davon auszugehen, daß das verminderte Wachstum der mit liposomal gebundenem Paclitaxel behandelten Tumoren von der zytotoxischen Wirkung des Paclitaxels auf die Endothelzellen der Gefäße bedingt ist. In der histologischen und der immunhistochemischen Untersuchung des Tumorgewebes wurde eine vermehrte Angiogenese bei den mit liposomal gebundenem Paclitaxel behandelten Tieren festgestellt. Besonders in den tumornahen Bereichen der Subcutis und unter der bindegewebigen Kapsel des Tumors trat eine im Vergleich zu den anderen Gruppen vermehrte Angiogenese auf. Auch konnte bei einer teilweise
vorliegenden Septierung des Blastoms eine verstärkte Gefäßbildung gefunden werden.
Es ist anzunehmen, daß durch die ständige Schädigung des Gefäßendothels das
umliegende Parenchym im Zustand der Hypoxie verbleibt und so die
angiogenetischen Induktoren wie z.B. VEGF, Interleukin, EGF vermehrt
Diskussion Seite 66
ausgeschüttet werden und dadurch bedingt eine erhöhte Angiogenese gefunden
wurde. Das VEGF eine wichtige Rolle in der Angiogenese von Tumoren spielt wurde
in verschiedenen Arbeiten dargestellt (Ferrara N. et al. 1997, Ferrara N et al.
2000)
Die durch kationische Liposomen ohne Wirkstoff Paclitaxel bedingte
Wachstumsreduktion ist ein Effekt der in allen Versuchen aufgetreten ist. Ebenfalls
wurde dieser Effekt in Vergleichsstudien mit anderen Tumormodellen beobachtet (Dr.
M. Teifel, mündliche Mitteilung), kann jedoch noch nicht sicher interpretiert werden.
Es ist darauf zu schließen, daß kationische Liposomen, wie von Thurston et al. (1998)
beschrieben, an Endothelzellen binden und so einen inhibierenden Effekt auf die
Tumorgefäße ausüben. Die genauen Mechanismen der Wachstumsinhibition von
kationischen Liposomen auf Endothelzellen sind jedoch noch zu klären. Die
Aufnahme der kationischen Liposomen in die Endothelzelle geschieht durch
Endozytose. Auch hier ist die Menge der bindenden Liposomen sowie die Aufnahme
von der Ladung der Liposomen abhängig (Miller C.R. et al. 1998). Die Wirkstoffe,
wie z. B. Paclitaxel, werden in der Zelle freigesetzt und sind so spezifisch für die
proliferierende Endothelzelle, da gerade bei diesen Zellen eine Affinität für die
Bindung kationischer Liposomen festgestellt wurde (Thurston G. et al. 1998). Im
Gegensatz zu der Paclitaxelformulierung im Taxol kann man annehmen, daß
liposomal gebundenes Paclitaxel bedingt durch die Größe der Liposomen nicht zu den
Tumorzellen diffundieren kann.
In der histologischen Untersuchung der Tumoren zeigte sich ein großer Anteil an
nekrotischen Bereichen in den Geschwulsten. Dies kann als eine Folge des schnellen
Wachstums der Tumoren angesehen werden. Die Zellmorphologie mit vielen
mitotischen Tumorzellen und unregelmäßigen Chromatinstrukturen im Zellkern wie
auch das schnelle Wachstum der Tumoren lassen auf eine hohe Malignität der
Tumorzellinie schließen. Bedingt durch stark nekrotische Areale im Tumorparenchym
konnte mit der X-Gal- Färbung nur ein geringer Teil des Gewebes angefärbt werden.
So zeigte sich eine gute Anfärbbarkeit der Tumoroberflächen im Gegensatz zu dem
intratumoralen Gewebe.

Zweifelsohne ist jedoch auf einen antiangiogenetischen Effekt, hervorgerufen durch
die Verabreichung der kationischen Liposomen, zu schließen. Der inhibitorische
Effekt von reinen Liposomen und Taxol ist gemessen am Tumorvolumen
vergleichbar. Ist nun von einer Wachstumsinhibition der Liposomen auf die
Endothelzelle auszugehen, so wird diese durch das Einschleusen von dem
Mitosehemmstoff Paclitaxel in die Zelle verstärkt. Bedingt durch die geringe
Plasmahalbwertszeit der kationischen Liposomen ist die Verfügbarkeit des Paclitaxels
an der Zelle bzw. der Tumorzelle geringer als die des konventionell genutzten Taxol®.
Die Wirkung des konventionellen Zytostatikums zielt auf die Tumorzelle selbst. In
Folge der längeren Plasmahalbwertszeit ist die Verfügbarkeit an der Tumorzelle weit
höher als die der Liposomen, die auf Grund ihrer Größe das Gefäßsystem nur schlecht
verlassen können und so kaum die Tumorzellen erreichen werden. Da wie aus den
histologischen Untersuchungen ersichtlich, die Tumoren größtenteils von einer
bindegewebigen Kapsel umgeben sind, stellt dies jedoch eine gewisse
Diffusionsbarriere auch für das Taxol® dar.
Innerhalb des kurzen Behandlungszeitraumes und bedingt durch das schnelle
Tumorwachstum ist eine Volumenreduktion in diesem Modell nicht zu erwarten. Es
ist jedoch zu beachten, daß der deutliche inhibitorische Effekt des an kationische
Liposomen gebundenen Paclitaxels auf die Tumorentwicklung eine spezifische
Wirkung entfaltet, die sich im Versuch als effektiver als die Wirkung des
Zytostatikums Taxol erwies. In einem Tumormodell mit langsamen Tumorwachstum
könnte eventuell eine Volumenreduktion erreicht werden.
Das verminderte Tumorwachstum war in beiden Versuchsansätzen des subcutanen
Modells zu sehen. Die Gruppenunterschiede erwiesen sich als signifikant. So gehen
wir davon aus, daß kationische Liposomen in einem frühen Wachstumsstadium eines
sich entwickelnden Tumors sowie an schon manifestierten Blastomen ihre Wirkung
entfalten können. An kationische Liposomen gebundenes Paclitaxel zeigte in beiden
Versuchen die potenteste Wirkung.

IV. 3 Metastasenmodell, Injektion von 1×105 Zellen i.v.,
Behandlungsbeginn ab Tag elf post Zellinjektion ( Versuch III)
Behandlungsbeginn ab Tag eins post Zellinjektion (Versuch
IV)
Zur Induktion von Lungenmetastasen wurden den BALB/c-Mäusen 1×105 Rencalac/
Z- Zellen i.v. in die seitliche Schwanzvene injiziert. Die Versuchstiere wurden in
Gruppen von je sechs Tieren geteilt und mit an kationischen Liposomen gebundenem
Paclitaxel, Liposomen , Taxol® sowie Glukoselösung durch intravenöse Injektion
behandelt.
In drei der vier durchgeführten Versuchsansätzen konnte die selbe Tendenz der
Resultate (deutlichste Wirkung auf das Tumorwachstum bei Einsatz von liposomalem
Paclitaxel) beobachtet werden. Abweichend davon zeigte sich bei der Behandlung der
in den Lungen der Versuchstiere induzierten Metastasen bei Behandlung elf Tage post
Tumorzellinjektion eine deutlichere Wirkung des Zytostatikums Taxol. Zudem
konnte im Metastasenmodell eine noch deutlichere Wirkung der kationischen
Liposomen ohne Paclitaxel auf das Zellwachstum, im Vergleich zu den Versuchen der
subcutan gesetzten Tumoren registriert werden. Diese Wirkung kann nach Aramaki
Y. et al. (1999 und 2000) auf die hohe Lipidaufnahme der Endothelzellen
zurückgeführt werden, die ebenfalls zur Induktion von Apoptose der einzelnen Zellen
führen kann (Aramaki Y. et al. 1999;. Aramaki Y. et al. 2000). Sollte dies zutreffen ist
der begleitende Effekt für die Therapie von Tumoren wünschenswert, für etwaige
diagnostische Einsätze jedoch, wie z.B. Tumordiagnostik mittels
fluoreszensmarkierter Liposomen oder als Carrier von kurativen Substanzen zur z.B.
Wundheilung wäre dieser Effekt jedoch kontraindiziert. Wie von Ellis LM. Und
Fidler IJ. (1996) beschrieben hängt der Grad der Metastasierung von der
Vaskularisation des Tumors ab. Mit der Reduktion der Angiogenese im Tumor sinkt
demnach auch das Metastasierungspotentioal eines Tumors.

In dieser Arbeit konnte eine statistisch signifikante Verbesserung der Wirksamkeit des
Paclitaxels im Vergleich zu der herkömmlichen Formulierung in Taxol® durch eine
Änderung der Galenik und so auch des Wirkmechanismus erzielt werden. Diese
Wirksamkeit zeigte sich in einer Reduktion des Tumorvolumens der mit liposomalem
Paclitaxel behandelten Versuchstiergruppen im Vergleich zu denen mit Liposomen
bzw. Taxol® behandelten Tiere. Ebenfalls konnte eine signifikante Reduktion der
Lungenmetastasen mit liposomalem Paclitaxel im Vergleich zu den anderen
Präparaten erzielt werden.

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(WO/2007/134819)

Cationic Liposomal Preparations for the Treatment of Rheumatoid Arthritis

It was surprisingly found, that unloaded cationic liposomes inhibit the release of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 in human vascular endothelial cells stimulated by TNF-alpha in an in vitro model system of RA.

This inhibitory effect an inflammatory processes was confirmed in several animal models of RA (Fig. 6- 10). It could also be shown that the inhibitory effect of unloaded cationic liposomes on the inflammatory process increases with the amount of cationic lipids comprised in the liposomes. Thus, the inhibitory effect of the respective liposomes increased with a positive zeta potential.

The basic principle of the present invention is not only limited to a therapeutic application within the field of rheumatoid arthritis or other disorders as indicated above but can also be utilized for diagnostic purposes. Thus, it is another aspect of the invention to use a liposomal preparation having a positive zeta potential and comprising at least one diagnostically active agent for the manufacture of a diagnostic composition for the diagnosis of rheumatoid arthritis or other disorders as indicated above by systemic administration.

In a further aspect the invention provides a composition comprising a cationic liposomal preparation comprising methotrexate. Preferably, the cationic liposomal preparation comprises a cationic lipid in an amount of at least about 40 mol%, preferably at least about 70 mol% and optionally at least one further amphiphile in an amount of up to about 50 mol% and methotrexate in an amount of up to about 20 mol%.

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